PEWARNAAN MIKROBA (PEWARNAAN GRAM DAN SPORA)

Laporan Praktikum                                         Nama               : 

Mikrobiologi                                                   NIM                :

Kelas               :

Kelompok       : 05

Hari/Tanggal   : Jumat/21 Maret 2014

Waktu             : 13.00-17.00

PJP                 : Emil Wahdi

Asisten           : Ramadhani

                       : Ivone

PEWARNAAN MIKROBA

(PEWARNAAN GRAM DAN SPORA)

TEKNIK DAN MANAJEMEN LINGKUNGAN

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

PENDAHULUAN

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme  yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik. Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler). Mikroorganisme yang hidup di alam memiliki morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. (Margaret F W 1989).    

Orang yang pertama melakukan Metode pengecatan yaitu Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004)

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990) Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain dengan Pewarnaan Sederhana yaitu merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin, Pewarnaan Gram yaitu merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D, Pewarnaan Kapsul yaitu Pewarnaan mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel, Pewarnaan Spora
yaitu  pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. (Hans)

Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.

TUJUAN

            Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram dan pewarnan spora serta pentingnya memahami setiap langkah dalam prosedur tersebut.

                                                                                    

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunkan yaitu jarum ose, gelas objek, botol semprot, mikroskop, bunsen, pemanas listrik, bak pewarna,Bunsen dan kertas serap. Bahan yang digunakan yaitu biakan bakteri 24jam (e.coli dan bacillus), satu set pewarnaan gram ( kristal violet, kalium iodida, etanol 96%, safranin, dan malacite green), dan aquades.

METODE

Pewarnaan Gram

Bakteri Bacillus Sp,Ecoli  dipersiapkan terlebih dahulu,Kaca Preparad/Objek gelas disterilkan dengan bantuan Bunsen dan alchol,agar tidak terjadi kontaminasi pada objek gelas,bakteri di usapkan pada permukan kaca preparat dengan ose,lakukan dengan setipis mungkin dan jangan terlalu tebal,sebab akan sukar di amati karna bakteri akan bertumpuk,objek gelas di keringkan di daerah sekitar Bunsen agar bakteri kering dan menempel pada objek gelas,zat warna 1 (ungu violet) di teteskan pada kaca preparat dan biarkan selama kurang lebih 20 detik,kaca preparat dibilas dengan aquades sehingga ungu violet yang ada pada kaca preparat larut dan telah terserap dan biarkan selama 2 detik, kaca preparat di teteskan dengan larutan iodine dan biarkan selama 30 detik sampai dengan 1 menit,bilas kembali kaca preparat yang telah di tetesi dengan iodine dengan aquades dan biarkan selama 2 detik, kaca preparat di cuci dengan alchol hingga larutan yang berwarna sudah tidak mengalir kembali, kaca preparat dinilas kembali dengan larutan aquades dan tahap yang terakhir dalam pewarnaan tersebut adalah kaca preparat di cuci dengan larutan pewarna yang ke 2 (Safranin),Amati kaca preparat di bawah lensa mikroskop dari mulai perbesaran 4x hingga 100x dan gunakan minyak inersi untuk mempermudah kita pada saat pengamatan dengan perbesaran 100x.

Pewarnaan Spora

Seperti halnya pewarnaan Gram perwarnaan spora juga Pertama fiksasi bakteri yang akan diamati, kemudian genangi olesan bakteri dengan malacite green yang diletakkan diatas pemanas selama 2-3menit dan jaga agar pewarna tidak menguap dan mendidih, setelah itu dinginkan dan bilas dengan aquades serata keringkan dengan hati-hati, setelah itu tambahkan safranin dan tunggu selama 30detik, kemudian bilas dengan aquades dan keringkan, terkhir amati di bawah mikroskop sampai perbesaran 1000x menggunakan minyak emersi.

Gambar skematik Pewarnaan Gram dan Spora

 

Data dan Hasil Pengamatan

Tabel hasil pewarnaan gram :

Bakteri	gram	morfologi
E.coli	-
Bacillus	+	Basil

Keterangan :    +          = bakteri berwarna ungu

 -          = bakteri berwarna merah muda

Tabel hasil pewarnaan spora :

Bakteri	gram	morfologi
Bacillus	+	Basil

Keterangan :    +          = membentuk spora dan berwarna hijau

Gambar dari hasil Pengamatan

Nama Bakteri	Gambar
Ecoli
Bacillus Sp
Spora

Pembahasan

Pewarnaan Bakteri dilakukan untuk mengidentifikasi bentuk  bakteri dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, dan bacillus, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli. ( James 2002).

Bakteri Gram – Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel cukup tebal (20 - 80 mm) dan terdiri atas 60 % sampai 100 % peptidoglikan yaitu polimer N – asetil glukosamin dan asam N – asetil muramat + beberapa asam amino yang menyusun dinding sel yang kaku pada organisme prokariota. (Kusumatdji,2008). Sedangkan  Bakteri Gram – Negatif  Adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan peptidoglikan lebih sedikit dari bakteri Gram – Positif, yaitu hanya sekitar 10 % sampai 20 % bobot kering dinding sel nya, akan tetapi diluar lapisan peptidoglikan terdapat struktur membran ke dua yang tersusun dari protein fosfolipida (komposisi lipid specifik dari membran sel) dan lipopolisakarida (asam lemak yang dirangkai dengan polisakarida), komponen – komponen ini sangat penting karena toksisitas nya pada hewan maupun manusia dan lebih dikenal dengan istilah endotoksin (molekul lipopolisakarida yang berukuran besar pembentuk komponen sel bakteri), endotoksin inilah yang dapat menimbulkan demam tinggi dan goncangan terhadap hewan atau manusia selama terjadinya infeksi sewaktu kemasukan bakteri gram - negatif (Kusumatdji 2008)

Kelebihannya dari pengecatan gram ialah sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana), uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro. Sedangkan Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Sedangkan Pewarnaan Spora Merupakan pewarnan tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.Spora bakteri sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  karbol-fukhsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam Mycolic dari Mycobacterium

Data dan hasil pengamatan yang saya lakukan di atas menunjukkan bahwa bakteri e.coli termasuk  gram negatif dengan morfologi sel basil (batang) Sedangkan bakteri bacllus termasuk gram positif dengan morfologi sel batang atau basil.

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora juga disebut endospora yang masih terletak didalam sel bakteri. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif, Sporulasi (proses pembentukan spora) dapat dicegah apabila selalu diadakan pemindahan biakan ke medium yang baru (Sudjadi 2006).

Pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit, bakteri penghasil endospora akan menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan hijau malasit tidak dapat diikat (Pearce 2009).

            Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus memiliki endospora yang terletk di subterminal (pelezar 2008). 

Kesimpulan

            Teknik pembuatan pewarnaan Gram. tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi, tipe utama diantaranya ialah terminal, subterminal dan sentral.

DAFTAR PUSTAKA

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. 

Margareth F W. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikroboilogi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press

Tesis “EVALUASI KONTAMINASI BAKTERI PATHOGEN PADA IKAN         SEGAR DIPERAIRAN TELUK SEMARANG “ Kusumatdji,UNDIP,2008.

Pelczsar, M dan Chan, ECS. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Universitas Indonesia Press, Jakarta. 

Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari : Anatomy and Physiology for Nurses (halaman : 200)

James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Retno Indah, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Principles of Science for Nurses (halaman : 115)