IDENTIFIKASI MIKROBA DENGAN KIT API 20E DAN TEKNIK MOLEKULER : PCR

Laporan Praktikum                                                     Nama                   :

Mikrobiologi Dasar dan Lingkungan                          Kelompok           :

NIM                     :

Waktu                 : 07.30 – 10.50 WIB

PJP                      : Emil Wahdi. S.si.

Asisten                : Ramdhani    

      Genny A

      Arif

IDENTIFIKASI MIKROBA DENGAN

KIT API 20E DAN TEKNIK MOLEKULER : PCR

TEKNIK DAN MANAJEMEN LINGKUNGAN

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2013

Pendahuluan

            Biologi Molekular adalah cabang ilmu biologi tingkat molekul, Bahan ajarannya mencakup biologi, kimia, partikel genetikm dan biokimia. Biologi molekuler konsentrasi terutama pada pengertian interaksi antar beberapa jenis sel, termasuk interaksi antara DNA, RNA, dan biosintesis protein.

Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Wahyudi 2001).  Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Tekni penggandaan DNA ini dapat membantu dalam identifikasi bakteri maupun virus yang mencemari makanan. PCR adalah suatu teknik yang sangat menolong, setelah dilakukan prosedur yang cukup rumit untuk mendapatkan urutan DNA yang cukup. Teknik PCR inilah yang memungkinkan proses analisis DNA menjadi lebih cepat dibandingkan dengan melakukan tes DNA dengan cara konvensional. Dengan PCR, urutan DNA dapat digandakan (amplifikasi) hanya dalam waktu beberapa jam sampai kuantitasnya cukup untuk sebuah proses analisis, hasil penggandaan dapat divisualisasikan menggunakan elektrofores dan Gel Documentation. (Harriganw 1998)

API-20E test kit untuk identifikasi bakteri enterik. menyediakan cara mudah untuk menyuntik dan membaca tes yang relevan kepada anggota Enterobacteriaceae keluarga dan organisme terkait. Sebuah strip plastik isinya dua tabung mini uji diinokulasi dengan suspensi garam dari kultur murni. Proses ini juga rehydrates media dessicated di setiap tabung. Beberapa tabung terisi penuh dan beberapa tabung yang dilapis dengan minyak mineral sehingga reaksi anaerobik dapat dilakukan.

Tujuan

            Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara dan proses identifikasi DNA mikroba yang baik dan benar dengan menggunakan metode KIT secara konvensional dan molekuler.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan ialah API 20E, Bunsen, tisu, pipet mikro, yellow tip, blue tip, tabung evendorf, tabung PCR, thermal cycler, centrifuge portable, vortex mixer, dan alat elektroforesis.

Bahan-bahan yang digunakan adalah biakkan bakteri dalam cawan petri, akuades, gel agarose, TEA, dd H2O, primer F, primer R, d NTP (d GTP, d CTP, d ATP, d TTP), buffer, taqpol, MgCl2, dan alkohol 70%. Bakteri. Kultur beku Streptococcus pyogenes galur UAB200, CS24 dan M24, E coli DH 5α dan Pseudomonas aeruginosa galur PAO sebagai kontrol diperoleh dari PPAU-Bioteknologi ITB Bandung. Sebagai kontrol positif digunakan plasmid pD3 yang merupakan plasmid rekombinan dengan gen emm 12 sebagai sisipannya dan Streptococcus spp. galur B7. Media dan Bahan Kimia. Blood agar plate dari Biofarma; media cair TSB (Tryptic Soy Broth); bufer Tris-HC1 10 mM pH 7,6 EDTA 1 mM, SDS 10%; larutan fenol: kloroform (1:1); natrium asetat 3 M; agarosa (Promega Corporation, Madison, USA); TAE 50x (242 gr Tris base, 57,1 ml asam asetat glacial, 100 ml 0,5 M EDTA pH 8 dalam 1 liter aquades); etidium bromida (10mg/ml); loading buffer (0,25% bromofenol biru 0,25% xylene cyanol F.F, 15% ficol); larutan standar DNA yang direstriksi dengan l μM (urutan nukleotida 5' GCC GCC.

Prosedur Kerja

            Metode yang digunakan untuk identifikasi mikroba pada praktikum kali ini ada dua jenis, yaitu dengan KIT secara konvensional dan KIT secara molekuler. Metode KIT secara konvensional dilakukan dengan menggunakan API 20 E. sedangkan untuk metode KIT secara molekuler dilakukan dengan teknik PCR.

Metode pertama yang dilakukan adalah KIT secara konvensional. Pertama kotak API 20 E dibuka dan disiapkan cawan petri berisi biakkan mikroba yang akan digunakan (dalam hal ini digunakan E. Coli sebagai sampel). Setelah itu API NaCl 5 ml diambil dan dibuka tutupnya dengan cara tutupnya ditekan ke bawah. Kemudian biakkan diambil sebanyak 1 swap, dimasukkan API NaCl 5 ml, dan dihomogenkan. Diambil wadah yang mirip jajaran sepatu-sepatu kecil dan wadah tutupnya. Tulisan di bawah sepatu-sepatu tersebut diperhatikan. Bila ada garis bawahnya, diisi larutan NaCl + biakkan (larutan sampel) setengah dari sepatu dan ditambah mineral oil (digunakan gliserol sebagai pengganti). Bila ada tanda        di bawah tulisannya, diisi sampel hingga penuh. Jika sudah ditutup dengan tutup wadahnya dan diinkubasi selama 48 jam. Selama proses pengerjaan, dilakukan di dekat api Bunsen agar steril.

Langkah pertama untuk ekstraksi DNA adalah sel dikumpulkan dengan cara sentrifugasi cairan kultur  8000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah itu supernatant yang terbentuk dibuang dan pelletnya ditambahkan 1 ml akuades. Selanjutnya larutan suspense yang terbentuk dipindahkan dalam tabung evendorf dan disentrifugasi pada kecepatan maksimal. Supernatant dibuang kembali, ditambahkan 1 ml CTAB 2%, diaduk, dan diinkubasi selama 30 menit. Disentrifugasi pada kecepatan maksimum dalam tabung evendorf sentrifugasi. Kemudian supernatant dipindahkan ke tabung evendorf baru, ditambahkan kloroform-isoamil alkohol 24:1, dan dihomogenkan dengan cara membuat angka 8 selama 1 menit. Disentrifugasi kembali 13000 rpm pada 4°C selama 30 detik. Hasil supernatant dipindahkan ke tabung baru dan dilakukan kembali langkah penambahan, penghomogenan, dan sentrifugasi. Setelah itu supernatant dikumpulkan pada tabung baru dan ditambah 1/10 volume dari 7,5 M ammonium asetat.  Ditambahkan 2 volume etanol mutlak dingin (-20°C), dihomogenkan, dan didiamkan selama 5 menit. Disentrifugasi dalam evendorf sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatant dibuang, pellet DNA dicuci dengan 0,5 ml etanol 70% dingin. Pellet dibiarkan kering selama kira-kira 15 menit, terakhir ditambah akuabides 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.

Penyiapan gel agarosa. Agarosa 1% dan 1,5 % dibuat dalam bufer 1x TAE, didinginkan sampai suhu 600C, kemudian ditambahkan 1 μl larutan etidium bromida (10 mg/ml), lalu diaduk. Larutan agar dituangkan kedalam plat. Kemudian ditambahkan 10 μl sample DNA dicampur dengan 2 μl loading buffer dimasukkan kedalam sumur. Marker DNA yang ukurannya diketahui (λ n film kecepatan tinggi.

           

Hasil Data

Gambar 1. Hasil Positif dan Negatif dari sampel dengan KIT API 20E

Gambar 2. Hasil perubahan warna setelah 24 jam dengan KIT API 20E

Gambar 3. Hasil Akhir DNA yang terdapat dalam sampel dengan KIT API 20E

           

Pembahasan

            Dalam KIT API 20 E terbaca pada strips yang terisi penuh yaitu CIT, VP, dan CEL semua berubah warna kecuali VP, karena VP hanya menghasilkan gelembung kecil. Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh hasil identifikasi bakteri yaitu Serratia fecaria. Keakurasian identifikasi sampel mencapai 98,9%. Hasil ini bertentangan dengan sampel yang telah diketahui yaitu  Esserchia coli. Kemungkinan terjadi kontaminasi padaa saat penentuan atau kesalahan terdapat pada pelabelan.

Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara konvensional dan caraKIT identifikasi. Cara konvensional meliputi fisiologis maupun biokimia. Cirifisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang penting di dalam identifikasispesies bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yangmemadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan.. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe mediamemproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikrobadengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray2005).

Isolasi Kromosom Bakteri Patogen Streptococcus pyogenes galur UAB200, CS24 dan M24. Streptococcus pyogenes adalah bakteri gram positif yang mempunyai dinding sel tebal sehingga sukar untuk dilisis. Untuk itu lisis dilakukan dengan dua cara yaitu dengan metode Bollet (Kaufhold et al,1994) dan dengan tambahan perlakuan 3 kali proses cair-beku kemudian baru dilisis dengan microwave. Ternyata dengan penambahan tahap pencucian dengan aquades steril dan tahap freeze-thaw, didapatkan jumlah kromosom yang lebih banyak. DNA hasil isolasi kromosom dengan metode Bollet, dipresipitasi denganetanol dengan tujuan untuk pemekatan sekaligus Deteksi Streptococcus pyogenes dengan PCR 3 pemurnian kromosom. Endapan pelet putih dilarutkan dalam 25 μl aquabides steril. Larutan diuji keberadaan DNA-nya dengan elektroforesis agarosa. Pada lisis kromosom cara pertama (metode Bollet) data elektroforesis menunjukan bahwa pada supernatan terdapat kromosom galur UAB200, CS24 dan M24 (Gambar 1a). Sedangkan pada endapannya tidak dijumpai kromosomnya (data tidak ditunjukkan) Ini mungkin disebabkan karena konsentrasi kromosomnya relatif rendah sehingga tidak dapat meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jika konsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCR akan rendah. mPCR dapat dilakukan walaupun hanya menggunakan sampel tanpa isolasi DNA, tetapi DNA templat yang dipersiapkan pada percobaan mengandung SDS dan deterjen yang menghambat mengendap. Untuk mendapatkan jumlah kromosom yang banyak digunakan lisis cara kedua. Cara ini lebih baik, hasilnya dapat dilihat pada Gambar 1b. Amplifikasi Gen emm6, Penempelan primer yang terjadi pada temperatur rendah tidak spesifik sehingga akan menghasilkan amplifikasi dengan spesifisitas rendah. Spesifisitas rendah juga menurunkan sensitifitas karena adanya kompetisi antara produk spesifik dan nonspesifik (Retnoningrum 1997). Primer yang digunakan adalah 0,5 μM, karena jika konsentrasi primer terlalu tinggi dapat terjadi mispriming yang mengakibatkan enzim Taq DNA polimerase sehingga dapat menurunkan efisiensi PCR. Untuk itu perlu dilakukan presipitasi dengan etanol sekaligus untuk pemekatan kromosom. Deteksi Produk PCR dengan Metode Elektroforesis Agarosa. Hasil elektroforesis produk amplifikasi PCR sebanyak 30 siklus melalui tiga tahap yaitu denaturasi, penempelan dan polimerisasi dapat

Menurut hasil yang dipublikasi bahwa ukuran panjang gen emm6 adalah 1452 pb. Dari hasil elektroforesis ukuran panjang gen emm6 adalah 1495 pb. Hasil ini mendekati ukuran panjang gen emm6 yang telah dipublikasi (Hollingshead et al, 1986). Produk PCR gen emm12 mempunyai ukuran panjang antara 1600 pb dan 1800 pb. Ukuran panjang gen emm12 yang telah dipublikasi yaitu 1693 pb. Hasil elektroforesis produk PCR gen emm12 adalah 1700 pb. Hasil ini mendekati ukuran panjang gen emm12 yang telah dipublikasi (Robbins et al, 1987). Pada percobaan ini juga digunakan kromosom galur M24 sebagai templat. Setelah diamplifikasi dengan teknik PCR dan produknya dielektroforesis ternyata tidak berhasil diperoleh produk PCR. Ini mungkin disebabkan karena adanya inhibitor amplifikasi atau primer yang digunakan tidak dapat menempel dengan efisien pada templat. Menurut hasil yangdipublikasi (Mouw et al, 1988) bahwa ukuran panjang gen emm24 adalah 1617 pb.

Kesimpulan

            isolasi kromosom galur UAB200, CS24 dan M24 sebagai templat telah berhasil dengan baik . Setelah amplifikasi diperoleh produk PCR gen emm6 dengan ukuran panjang 1495 pb, sedangkan gen emm12 adalah 1700 pb.

            Bakteri yang teridentifikasi dari dalam peralatan KIT API 20E adalah Serratia fecaria, dan tidak sesuai dengan sampel.

Daftar Pustaka

Erlich HA . 1989. PCR Technology: Principles and Applications for DNA

Amplification. New York (US) : M stockton press.
Harriganw F . 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. New York (US)
          Academic Press Ltd

Hollingshead SK, Fischetti VA & Scott JR. 1986. Complete nucleotide sequence
                       of type M protein of the group a Streptococcus. J. Biol. Chem. 261: 1677-1688.

Kaufhold A, Podbielski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J. & Schouls L, 1994.
           Rapid typing of group a streptococci by the use of DNA amplification and
           nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology
            Letters 119: 9-26.

Mouw, A.R., Beachey, E.H. & Vickers, B. 1988. Molecular evolution of
              Streptococcus M protein cloning and nucleotide sequence of type 24 M      
              protein gene and relation to other gene of Streptococcus pyogenes. J.
              Bacteriol. 170: 676- 684.

Murray RK, DK Granner, PA Mayes and VW Rodwell. 2000. Biokimia
             Harper.Edisi25.Buku Kedokteran. Jakarta (ID) : EGC

Retnoningrum DS .1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk
             diagnosis penyakit infeksi [Skripsi]. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.

Robbins JC, Spanier JG, Jones SJ, Simpson WJ & Cleary, P.P. 1987. Streptococcus  
              pyogenes type 12M protein gene regulation by upstream sequences. J.
             Bacteriol. 169: 5633-5640.